【行業(yè)新聞】質譜是怎樣做到定量的？

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時間：2017-09-28 12:05

注：這里的定量指的是待分析物的含量質譜可以通過分子量信息定性（結構），但根據我的理解，質譜信號的強度是和離子化難易相關，并不能反應待分析物的含量（定量）

作者：胡墨

　　1. 質譜信號強度與待分析物含量的關系

任何定量分析方法都需要建立實驗測量信號與待分析物的量的關系。很幸運的是，在質譜中，通常也可以建立這樣的關系，因此質譜信號是可以用于定量的。從題主的說明來看，Ta的疑惑主要在這里。既然問題是“質譜是怎樣做到定量的？”，我們不妨把質譜信號的產生按時間順序粗略分為三個步驟，即離子的產生，傳輸與檢測。

產生離子時，不同樣品分子的電離通常是相互獨立的。因此樣品量越多，其產生的離子也就越多。目前常用的各種離子化方法（EI、ICP、ESI、MALDI等）在實驗中（嚴格來說僅在一定濃度范圍內——術語是動態(tài)范圍，dynamic range）都至少滿足樣品量與產生離子量的正相關，一般情況下也可以進一步近似成線性相關。

傳輸離子時，簡單來說可以認為傳輸效率與被傳輸離子的量無關；（嚴格地說，被傳輸的離子太多時，相同電荷的互相排斥會造成離子束的“體積”變大，導致傳輸效率下降。這種影響在空間有限的離子阱中表現得更加明顯，因此在離子阱質譜中一個重要的技術就是適當控制進入儀器的離子數量，使其既不太少也不太多。）

檢測離子時，不論是使用光電倍增管的檢測器，還是檢測鏡像電流的檢測器（ICR/Oribtrap），其信號強度（在一定范圍內）均與離子數量大致線性相關。

廢話幾句，可能會使題主感覺質譜不能定量的原因之一是，我們看到的質譜圖常用相對強度作為縱坐標，即0-100%最強峰，而不展示信號的絕對強度。但在做質譜的時候，儀器記錄的當然是絕對強度（相對強度也是通過絕對強度換算出來的）。我們需要用絕對強度來定量時，就需要這部分平時不?？吹男畔⒘恕?/p>

另外，在談到色譜-質譜聯用方法時，待分析物與實驗測量信號的關系之中又多了一層色譜，即待分析物含量->色譜流出物中樣品含量->質譜信號。與EI譜圖分析以相對強度為主不同，在色譜-質譜聯用時，信號的絕對強度就成了我們天天都要關心的內容，因為質譜信號強度隨時間的變化就是實驗的色譜圖，通常以總離子強度或者某一特定質荷比離子的強度作圖。

2. 定量的兩種方法

說過了為什么質譜可以定量，下面我們來看看具體的定量方法。常用的定量方法有兩種，外標法與內標法。

外標法

用已知量的標準樣品A和未知量的待測樣品A分別進行實驗；我們會得到以下三個信息：標準樣品的量（已知）；標準樣品的信號強度；待測樣品的信號強度。（假設樣品的響應=常數*濃度，從這三個信息即可算出待測樣品的量。）

為了更加精確地測定未知量的樣品，我們希望標準樣品的信號強度與待測樣品的信號強度盡量接近（以減少非線性響應的影響）。因此常用的外標法會測量一系列已知量的標準樣品，繪制一條工作曲線，再用擬合的方法確定未知樣的量。

內標法

外標法主要有以下兩方面的局限：1標樣和待測樣是獨立進行實驗的，實驗間的偶然誤差無法消除；2標樣和待測樣的基質（即除待分析物外的其它成分）不同，基質有可能會帶來不同的影響，也會產生誤差。

那么，如果我們把已知量的標準樣品B直接加入待測樣品A，就可以把標準樣品和未知樣品的測定在同一次實驗和同樣基質中完成，也就消除了兩次實驗和基質不同造成的誤差，這就是內標法。（如果加入的標準樣品和待測樣品是同種物質A，那么由于它們不可區(qū)分，只通過一次實驗是不能定量待測樣的，這時我們在加入標樣前后分別進行兩次測量，即測量待測樣及待測樣+標樣的信號，即可計算出待測樣的量。）

3. 質譜相關的特殊定量細節(jié)

同位素稀釋

前面內標法的介紹中我們可以發(fā)現，最理想的內標物既要和待測樣相同（具有相同的響應系數）又要不同（儀器可以區(qū)分二者的信號），這對矛盾的集合體就是同位素內標。

由于不同同位素的化合物具有近似相同的物理化學性質，離子化時的響應通常也是相同的，而它們具有不同的質荷比m/z，即可在質譜中被區(qū)分出來。因此同位素標準品是最理想的內標物。

另外，由于某些元素的天然同位素分布有一定的比例，當我們加入一定量的同位素內標時，可以把對信號絕對強度的測量轉化為對信號相對比例的測量，從而提高實驗的準確性。

選擇反應監(jiān)測

在不太復雜的體系中，我們只要按照分子量就可以定性某種化合物了。但對于復雜混合物（如石油產品/生物樣品）而言，很多化合物具有相同或相近的質量（同分異構體質量完全相同，有些化合物分子量非常接近，如CO和N2，要考慮儀器的質量分辨率是否能區(qū)分二者），此時僅靠測量質量就不能確定這個化合物是否就是我們關心的“the one”了。

在串聯質譜 (Tandem MS) 儀器中，我們不僅可以把質譜儀理解為一個稱量離子的“天平”，它還具有了離子“鑷子”（選擇某個特定的離子把它分離出來）和“剪刀”（把某個/某些離子激活并打成碎片）的功能。

通過母離子和子離子的兩步選擇，我們可以在復雜體系中精確定位到我們關心的化合物，同時，兩次離子選擇還可減少復雜基質的干擾，降低背景噪聲（獲得更低的檢出限）并提高方法的動態(tài)范圍。因此選擇反應監(jiān)測是目前色譜（氣相色譜/液相色譜）-質譜聯用中最常用的定量方法。