HPLC 的正確使用和科學(xué)保養(yǎng)
特別提示:反復(fù)認(rèn)真地閱讀儀器使用說(shuō)明書(shū) , 做到對(duì)儀器的主要部件如進(jìn)樣閥、高壓輸液泵、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理機(jī)的功能、特點(diǎn)及其相互關(guān)聯(lián)匹配情況 ,熟悉、理解 ,融會(huì)貫通。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求 ,進(jìn)行規(guī)范操作 ,這是正確使用和科學(xué)保養(yǎng)儀器的前提。
1、保持貯液瓶清潔 ,對(duì)專用貯液瓶應(yīng)定期清洗;用試劑瓶作貯液瓶時(shí) ,要經(jīng)常更換。
2、定期(如半個(gè)月) 在稀硝酸溶液中超聲、清洗過(guò)濾器 ,保持過(guò)濾器暢通無(wú)阻。
3、使用HPLC試劑和新蒸二次蒸餾水作流動(dòng)相,所使用的溶劑其截止波長(zhǎng)一定要低于檢測(cè)波長(zhǎng),對(duì)不是HPLC 級(jí)的試劑要進(jìn)行過(guò)濾(HPLC 級(jí)試劑出廠前已用 0. 02μm 濾膜過(guò)濾) 。對(duì)流動(dòng)相一定要脫氣。
4、每天開(kāi)始使用儀器,注意放空排氣 ,確保泵頭、流動(dòng)池以及其他流路系統(tǒng)中無(wú)氣泡存在。
5、珍惜保護(hù)色譜柱 ,避免柱頭突然產(chǎn)生大的波動(dòng) ,擾動(dòng)損傷柱床。如避免泵啟動(dòng)過(guò)速、升壓過(guò)快、樣品閥搬動(dòng)過(guò)慢所造成的柱壓大的波動(dòng)。
6、采用保護(hù)(警戒)柱 ,延長(zhǎng)柱壽命。如污染物堆積于保護(hù)柱柱頭 ,造成柱壓升高 ,柱效下降 , 峰形變差時(shí) ,卸下用強(qiáng)溶劑反沖后再用或更換新保護(hù)柱。
7、避免超負(fù)荷進(jìn)樣,對(duì) 250 ×4. 6 mm的柱子 ,絕對(duì)進(jìn)樣量應(yīng)不超過(guò)100μg。在靈敏度允許的前提下,應(yīng)盡量將試樣濃度降低 ,減少絕對(duì)進(jìn)樣量(進(jìn)樣體積可保持不變) ,這是保持HPLC 柱性能持久良好的重要舉措之一。
8、經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗柱子,將柱內(nèi)強(qiáng)保留組分及時(shí)洗脫出。反相柱用異丙醇 - 二氯甲烷(1 : 1)沖洗 ,正相(硅膠柱)用純甲醇或異丙醇沖洗 ,時(shí)間均不少于1 h。
9、做完試驗(yàn),及時(shí)用適當(dāng)溶劑沖洗柱子和進(jìn)樣閥,尤其是對(duì)過(guò)夜的柱子和進(jìn)樣閥 ,一定要用足量的水徹底洗凈其中的鹽類、緩沖液,再用甲醇或乙腈沖洗 ,并保存在乙腈中。正相柱保存在非極性有機(jī)溶劑(如己烷)中。
10、以硅膠為基質(zhì)的柱子,如 C - 18 ,C - 8 等 ,要控制好流動(dòng)相的pH值 ,一般不要低于2. 5 , 不高于7. 0。
11、盡量用流動(dòng)相溶解樣品 ,一是避免出現(xiàn)拖尾峰、怪峰 ,二是避免試樣在系統(tǒng)中由于溶解度降低而析出。
12、對(duì)于阻塞或受傷嚴(yán)重的柱子,必要時(shí),可卸下不銹鋼濾板 ,超聲洗去濾板阻塞物,對(duì)塌陷污 染的柱床進(jìn)行清除、填充、修補(bǔ)工作 ,此舉可使柱效恢復(fù)到一定程度(80 %) ,有繼續(xù)使用的價(jià)值。
13、色譜儀檢測(cè)器輸出與積分儀(處理機(jī)) 要匹配 ,要合理設(shè)置參數(shù)如斜率、半峰寬、閾值、 AUFS值、衰減等。將適宜的進(jìn)樣量和合適的參數(shù)結(jié)合起來(lái) ,使主峰峰高達(dá)到記錄儀滿量程的80 %左右。
14、用 HPLC 分析酸堿性物質(zhì),由于吸附作用(次級(jí)保留)使峰形拖尾。加入改良劑可以大大改善峰形 ,提高積分的準(zhǔn)確度。
一般規(guī)則是: （1）分析酸性物質(zhì) ,可加入 1 %的醋酸。
（2）分析堿性物質(zhì) ,可加入 10～20 mmol/ L 三乙胺。
（3）酸堿物質(zhì)混為一體 ,可同時(shí)加入1 %的醋酸和 10～20 mmol/ L 三乙胺。
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