自動(dòng)DNA合成儀的操作要點(diǎn)及故障排除介紹

自動(dòng)DNA合成儀的操作要點(diǎn)：

1．合成開始后檢查要點(diǎn)

合成開始時(shí)，檢查第二個(gè)核苷酸脫DMT所產(chǎn)生的橘色，保證一切正常。*個(gè)DMT的顏色不能作為提供資料的依據(jù)，因?yàn)樗禽d體上裝進(jìn)的*個(gè)核苷的量度。檢查合成柱是否滲漏，滲漏原因可能是由于柱子錯(cuò)誤或柱子與合成儀上的luer接頭未擰緊所致。檢查監(jiān)視器上的詳細(xì)內(nèi)容，必要時(shí)重新存儲(chǔ)所需參數(shù)。

2．自動(dòng)DNA合成儀上試劑的穩(wěn)定性

無論合成進(jìn)行到什么程度，試劑管道中的單體每幾分鐘就需要補(bǔ)充一次，不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的亞磷酰胺分解。但是如果儀器已經(jīng)1h以上未運(yùn)行，在合成開始前必須清洗試劑管路，除去管內(nèi)分解的試劑。即使在zui好的條件下，試劑的壽命也是有限的，因此，要將在合成儀上存放2周以上的試劑棄去；對于合成30個(gè)堿基12 1-_的寡核苷酸，應(yīng)用的亞磷酰胺和四唑在合成儀上的時(shí)間應(yīng)短于一周。對于合成50mer或更長的寡核苷酸，應(yīng)該用新鮮的亞磷酰胺、四唑和乙腈。

3．自動(dòng)DNA合成儀上的試劑更換

在某一合成期間任何一種試劑用完都會(huì)導(dǎo)致合成失敗，所以在合成前必須檢查所有儲(chǔ)液瓶內(nèi)的試劑量。如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度降至18~C以下，需要用電吹風(fēng)溫?zé)醿?chǔ)液瓶，使某些結(jié)晶溶解。如果一個(gè)位置配有一個(gè)一次性的瓶塞，當(dāng)新瓶子放到合成儀上時(shí)，要檢查并更換瓶塞。任何裂開的瓶塞都不能使用，*性的瓶塞也要檢查。另外，要檢查試劑瓶口邊緣是否有缺口，缺口瓶在合成儀上塞不緊，不能輸送試劑。

4．合成中更換試劑瓶

在特定循環(huán)上單體縮合、封閉、氧化完成后，等待用乙腈清洗，并中斷循環(huán)和三個(gè)柱。然后按正常方法換瓶，取消所有中斷信息，重新開始合成，千萬不要讓合成中斷超過lmin，這樣會(huì)使偶聯(lián)率下降或造成合成失敗。 

自動(dòng)DNA合成儀儀器的故障排除：

化學(xué)合成方法與生物化學(xué)方法之間有著顯著的差別，材料和方法上非常小的改變常常會(huì)在所獲得的產(chǎn)物以及保證可靠的合成路線之間造成差別。下面介紹幾個(gè)zui可能引起故障的經(jīng)驗(yàn)問題。

1．溶劑

大多數(shù)用在化學(xué)合成中的商品試劑都不夠純。因此使用前應(yīng)該進(jìn)行純化（常用方法：蒸餾）。對于“專為合成DNA純度”的溶劑也要檢查其顏色（幾乎所有的液體都是無色的）及透明度（顆粒將阻塞多孔玻璃，分子篩塵埃將造成合成失?。４蠖鄶?shù)有關(guān)的雜質(zhì)是水、酸、堿和金屬離子。

水：對吸收水的化學(xué)試劑蒸餾一次，大多數(shù)溶劑的水分將會(huì)減少到10btg／g或更少。因?yàn)樵谂悸?lián)步驟中允許少量水的存在，故這種水分含量的溶劑可用于合成。許多溶劑都是吸潮的，因此所有溶劑的容器都應(yīng)該塞緊，只能短時(shí)打開，通常沒有必要在氬氣中儲(chǔ)存。

酸和堿：氯化的碳?xì)浠衔锍：形⒘葵}酸，在合成期間會(huì)使二甲氧基三苯甲基損失。通過下列方法可以進(jìn)行檢測：在5ml溶劑中溶解lmg的5，—O—二甲氧基三苯甲基脫氧核糖核苷酸衍生物，測定495nm處的吸收值，應(yīng)該沒有吸收。極性溶劑中的一級(jí)和二級(jí)氨能切斷寡核苷酸與載體之間的鍵，可以用茚三酮試驗(yàn)檢測。

金屬離子：雖然溶劑中沒有這一問題，但作為干燥劑的分子篩含有大量的鐵。有些溶劑從分子篩中濾出三價(jià)鐵離子，這種分子篩與DNA鍵合，引起堿基修飾和核苷酸間的切除。其他金屬離子可能也是有害的。

2．試劑

DNA合成時(shí)，脫氧核糖核苷單體中小量的高反應(yīng)活性的雜質(zhì)造成的影響非常大。應(yīng)用大量過量單體，擴(kuò)大了雜質(zhì)的影響。檢測比較困難，但應(yīng)該引起高度注意。在催化劑、偶聯(lián)劑和脫保護(hù)劑中的雜質(zhì)一般影響較小。

3．儀器

DNA合成可以用很多不同類型的儀器進(jìn)行，總的原則是既能應(yīng)用于磷酰二酯法，也可用于亞磷酰胺三酯法。儀器一般分為4種類型：手動(dòng)、半手動(dòng)、半自動(dòng)化和自動(dòng)化（DNA合成儀）。DNA合成儀減少了合成所需的手工勞動(dòng)，但是儀器并不能取代人，機(jī)器的錯(cuò)誤是隨著儀器本身的檢察能力而變化的。甚至高級(jí)的儀器都還沒有能夠準(zhǔn)確地分析一個(gè)合成的成功與否或者根據(jù)提供的信息作調(diào)整的“反饋控制”。因此儀器并不是真正的“自動(dòng)”（注意：測量釋放的DMT基團(tuán)僅僅是一種機(jī)械的檢查，對可獲得的產(chǎn)物量不是可靠的指導(dǎo)，只是對鏈擴(kuò)增的效率有指導(dǎo)作用）?？傊?，無論選擇哪種類型的儀器，接觸溶劑的部分zui好選用玻璃或是聚四氟乙烯材料。 

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