自動DNA合成儀的操作要點及故障排除介紹

自動DNA合成儀的操作要點：

1．合成開始后檢查要點

合成開始時，檢查第二個核苷酸脫DMT所產(chǎn)生的橘色，保證一切正常。*個DMT的顏色不能作為提供資料的依據(jù)，因為它是載體上裝進的*個核苷的量度。檢查合成柱是否滲漏，滲漏原因可能是由于柱子錯誤或柱子與合成儀上的luer接頭未擰緊所致。檢查監(jiān)視器上的詳細內(nèi)容，必要時重新存儲所需參數(shù)。

2．自動DNA合成儀上試劑的穩(wěn)定性

無論合成進行到什么程度，試劑管道中的單體每幾分鐘就需要補充一次，不會出現(xiàn)嚴重的亞磷酰胺分解。但是如果儀器已經(jīng)1h以上未運行，在合成開始前必須清洗試劑管路，除去管內(nèi)分解的試劑。即使在zui好的條件下，試劑的壽命也是有限的，因此，要將在合成儀上存放2周以上的試劑棄去；對于合成30個堿基12 1-_的寡核苷酸，應用的亞磷酰胺和四唑在合成儀上的時間應短于一周。對于合成50mer或更長的寡核苷酸，應該用新鮮的亞磷酰胺、四唑和乙腈。

3．自動DNA合成儀上的試劑更換

在某一合成期間任何一種試劑用完都會導致合成失敗，所以在合成前必須檢查所有儲液瓶內(nèi)的試劑量。如果實驗室內(nèi)溫度降至18~C以下，需要用電吹風溫熱儲液瓶，使某些結(jié)晶溶解。如果一個位置配有一個一次性的瓶塞，當新瓶子放到合成儀上時，要檢查并更換瓶塞。任何裂開的瓶塞都不能使用，*性的瓶塞也要檢查。另外，要檢查試劑瓶口邊緣是否有缺口，缺口瓶在合成儀上塞不緊，不能輸送試劑。

4．合成中更換試劑瓶

在特定循環(huán)上單體縮合、封閉、氧化完成后，等待用乙腈清洗，并中斷循環(huán)和三個柱。然后按正常方法換瓶，取消所有中斷信息，重新開始合成，千萬不要讓合成中斷超過lmin，這樣會使偶聯(lián)率下降或造成合成失敗。 

自動DNA合成儀儀器的故障排除：

化學合成方法與生物化學方法之間有著顯著的差別，材料和方法上非常小的改變常常會在所獲得的產(chǎn)物以及保證可靠的合成路線之間造成差別。下面介紹幾個zui可能引起故障的經(jīng)驗問題。

1．溶劑

大多數(shù)用在化學合成中的商品試劑都不夠純。因此使用前應該進行純化（常用方法：蒸餾）。對于“專為合成DNA純度”的溶劑也要檢查其顏色（幾乎所有的液體都是無色的）及透明度（顆粒將阻塞多孔玻璃，分子篩塵埃將造成合成失敗）。大多數(shù)有關(guān)的雜質(zhì)是水、酸、堿和金屬離子。

水：對吸收水的化學試劑蒸餾一次，大多數(shù)溶劑的水分將會減少到10btg／g或更少。因為在偶聯(lián)步驟中允許少量水的存在，故這種水分含量的溶劑可用于合成。許多溶劑都是吸潮的，因此所有溶劑的容器都應該塞緊，只能短時打開，通常沒有必要在氬氣中儲存。

酸和堿：氯化的碳氫化合物常含有微量鹽酸，在合成期間會使二甲氧基三苯甲基損失。通過下列方法可以進行檢測：在5ml溶劑中溶解lmg的5，—O—二甲氧基三苯甲基脫氧核糖核苷酸衍生物，測定495nm處的吸收值，應該沒有吸收。極性溶劑中的一級和二級氨能切斷寡核苷酸與載體之間的鍵，可以用茚三酮試驗檢測。

金屬離子：雖然溶劑中沒有這一問題，但作為干燥劑的分子篩含有大量的鐵。有些溶劑從分子篩中濾出三價鐵離子，這種分子篩與DNA鍵合，引起堿基修飾和核苷酸間的切除。其他金屬離子可能也是有害的。

2．試劑

DNA合成時，脫氧核糖核苷單體中小量的高反應活性的雜質(zhì)造成的影響非常大。應用大量過量單體，擴大了雜質(zhì)的影響。檢測比較困難，但應該引起高度注意。在催化劑、偶聯(lián)劑和脫保護劑中的雜質(zhì)一般影響較小。

3．儀器

DNA合成可以用很多不同類型的儀器進行，總的原則是既能應用于磷酰二酯法，也可用于亞磷酰胺三酯法。儀器一般分為4種類型：手動、半手動、半自動化和自動化（DNA合成儀）。DNA合成儀減少了合成所需的手工勞動，但是儀器并不能取代人，機器的錯誤是隨著儀器本身的檢察能力而變化的。甚至高級的儀器都還沒有能夠準確地分析一個合成的成功與否或者根據(jù)提供的信息作調(diào)整的“反饋控制”。因此儀器并不是真正的“自動”（注意：測量釋放的DMT基團僅僅是一種機械的檢查，對可獲得的產(chǎn)物量不是可靠的指導，只是對鏈擴增的效率有指導作用）。總之，無論選擇哪種類型的儀器，接觸溶劑的部分zui好選用玻璃或是聚四氟乙烯材料。 

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